La Tripla Tecnologia, il punto di partenza e la continuità operativa del CAAM.
Biotechnology
La biotecnologia è in qualche modo una scienza antica. Il termine può assumere diversi significati, che però riassumono sempre i processi che l’uomo ha saputo creare, utilizzando strutture o sistemi biologici, per poterli poi utilizzare per vivere meglio.
A questa definizione non si sottrae la biotecnologia applicata agli allergeni. Le metodiche biochimiche, sempre più precise e raffinate, permettono infatti di conoscere la sequenza e la struttura delle proteine, così come sono espresse (prodotte) nei loro tessuti naturali. La biologia molecolare, con l’introduzione della tecnologia del DNA ricombinante, ha invece reso possibile la produzione in laboratorio di molecole allergeniche clonate. Questi due approcci hanno permesso di conoscere meglio e reso disponibili migliaia di molecole allergeniche negli ultimi 30 anni. Il database Allergome, che classifica sia le fonti sia le molecole allergeniche, raccoglie ad oggi dati su circa 3000 allergeni molecolari, provenienti da oltre 2500 fonti allergeniche.
Questo aumento delle conoscenze ha segnato un passo avanti storico nella scienza allergologica perché ha permesso di valutare con precisione le interazioni tra il sistema immunitario e le strutture allergeniche. Questo non era prima possibile con l’uso degli estratti allergenici. Quest’ultimi, pur sempre utilizzati come passaggio tecnico necessario per ottenere informazioni sulle molecole allergeniche, permettono di misurare l’interazione tra le IgE e numerose proteine allergeniche contemporaneamente.
Da venti anni i ricercatori del CAAM operano in collaborazione con laboratori di biochimica e di biologia molecolare all’identificazione di un numero crescente di molecole allergeniche, e alla loro caratterizzazione biochimica e immunologica, ma soprattutto alla definizione del ruolo delle molecole allergeniche nella storia clinica delle malattie da allergia IgE-mediate. L’utilizzo delle micro e nanotecnologie, che richiedono quantità minime di preparati allergenici, ha permesso di operare indifferentemente sia con molecole naturali altamente purificate sia con molecole clonate sia con estratti attentamente caratterizzati, permettendo inoltre la valutazione comparativa della qualità dei diversi prodotti in laboratorio. Primo obiettivo raggiunto è stato lo sviluppo di sistemi diagnostici moderni per l’allergologia. Obiettivo finale delle biotecnologie sarà la produzione di molecole allergeniche per la terapia delle allergie.
Micro and Nano-technology
La microtecnologia inizialmente e la nanotecnologia rappresentano il secondo strumento tecnologico di base delle attività di ricerca e assistenza del CAAM. Disponibile da circa 20 anni la prima più di recente la seconda, sono state usate prima per la ricerca biologica e solo successivamente per le applicazioni cliniche in medicina come nel caso della diagnostica allergologica.
I primi microarray sono stati ottenuti con la deposizione di micro quantità di preparazioni allergeniche, su superfici preparate, mediante l’uso di spotter robotizzati. Gli spot dei microarray sono di dimensioni tra 50 e 200 micrometri (un micrometro = 0,001 mm). Si possono oggi produrre microarray con migliaia di spot. Nei microarray ogni spot occupa una precisa posizione. Oltre le microtecnologie su superfici piane, esistono microarray virtuali su microbeads fluorescenti, che permettono di ottenere risultati analoghi agli altri. Le microbeads, di dimensioni pari a 5-7 micrometri di diametro, hanno permesso di capire che è possibile sviluppare test diagnostici con elementi di dimensioni inferiori agli spot del microarray. La possibilità crescente di operare con materiali e strumenti nelle nanodimensioni (un nanometro = 0,000 001 mm) ha reso ancora più interessante e potente la sua applicazione alla diagnostica medica e in particolare alla diagnostica allergologica.
Tre le conseguenze logiche della microtecnologia ma ancor più della nanotecnologia. Prima conseguenza: per le micro e nanodimensioni di questi strumenti è possibile l’utilizzo di quantità minime di preparati allergenici. Si stima che in uno spot di un microarray si depositino circa 100 picogrammi (picogrammo = 0,000 000 001 mg) di proteine allergeniche purificate e che nelle nanodimensioni ne necessitino 100-1000 volte meno. Seconda conseguenza: l’immobilizzazione su di un micro o nanoarray di un numero crescente di preparati allergenici, sfruttando inoltre la possibilità di immobilizzare preparati diversi ma appartenenti a gruppi omogenei in modo da rendere il test diagnostico per l'allergia più robusto e completo. Terza conseguenza: la produzione di quantità crescenti, prima inimmaginabili, di dati diagnostici e scientifici dalla routine. Questi dati estremamente strutturati e conseguenti della elevata produttività ad alta efficienza dei sistemi in micro e nanotecnologia rappresentano un valore aggiunto della moderna diagnostica allergologica.
Information & Communication Technology (ICT)
La crescente potenza di calcolo dei computer, la riduzione progressiva delle loro dimensioni, l’aumento delle loro capacità di memoria, la creazione delle reti globali di scambio dei dati mediante Internet e il moltiplicarsi delle modalità di comunicazione, ormai praticamente senza limiti fisici, hanno fondato la nuova interazione tra tutti e cambiato gli stili di vita globalmente. Il trasferimento dell'ICT in biomedicina è stato progressivo, concentrandosi inizialmente solo sulla raccolta strutturata dei dati biologici (banche dati) e progressivamente, anche se molto più lentamente, dei dati clinici. Nel 2005 comincia lo sviluppo di nuovi sistemi d’interconnessione e di raccolta dati, centrando sulla piattaforma Allergome la possibilità di sviluppo di un network dedicato alla raccolta e gestione dati in allergologia.
Il CAAM, in collaborazione con Allergy Data Laboratories, ha quindi creato e sviluppato la prima vera rete di dati biologici e clinici in allergologia, dando una risposta concreta all’esigenza di gestire grandi quantità di dati diagnostici strutturati, senza essere sopraffatti dalla produttività ad alta efficienza dei sistemi in micro e nanotecnologia.
3 Tecnologie combinate per la diagnosi di allergia
Il percorso di sviluppo, acquisizione e utilizzo delle 3 tecnologie è sorprendentemente parallelo. Gli ultimi decenni hanno quindi posto le premesse tecnologiche per lo sviluppo di nuovi sistemi da applicare in biomedicina e quindi anche in allergologia. È il 1999 quando il Dr. Mari per la prima volta sente il Prof. Valenta parlare della possibilità di sviluppare un “test molto piccolo, grande come l’unghia del pollice, ma che contiene decine di test molecolari, e utilizza piccolissime quantità di ogni allergene”. Il Prof. Valenta gli chiede di contribuire con Jun o 4, il pan-allergene precedentemente clonato a Roma grazie anche al contributo clinico del Dr. Mari, poi utilizzato per il primo microarray molecolare per la determinazione delle IgE. Quest’ultimo è oggetto di una pubblicazione scientifica nel 2002 dove, per la prima volta, si parla di diagnostica allergologica in microtecnologia con molecole allergeniche.
Nel 2003 il Dr. Mari entra in contatto per la prima volta con Reinhard Hiller, uno dei tre inventori di quello che sarà chiamato successivamente ISAC test. Insieme cercano di capire se il test per il dosaggio delle IgE in microtecnologia, di cui era stata data solo un’evidenza sperimentale, possa essere trasformato in un nuovo sistema diagnostico per la routine allergologica. In seguito, a Vienna, il Dr. Mari conoscerà anche gli altri due inventori, Manfred Müller e Christian Harwanegg. È con loro, coadiuvati da Sabine Hutter, tutti impiegati a vario titolo nella VBC-Genomics di Vienna, che comincia il percorso di sviluppo del test ISAC così come è oggi disponibile. Nel 2004-2005 vengono create delle versioni sperimentali del test, incrementando i 29 preparati allergenici iniziali a 51, 71, 73, e poi 74 molecole allergeniche. Quando ISAC raggiunge il numero di 76 allergeni viene considerato idoneo all’inizio dell’attività diagnostica di routine presso il CAM. Grazie all’interazione costante tra l’azienda viennese e gli attuali esperti del CAAM, ISAC continua a crescere, passando a 79, 85, 89, e 103 molecole allergeniche. Un numero crescente di queste è prodotto nel laboratorio del CNR di Napoli della Prof. Ciardiello. La fase di validazione clinica di tutte le versioni è sempre eseguita dagli attuali esperti del CAAM.
Crescendo il numero di allergeni disponibili sul test ISAC, cresce la necessità di gestire in modo idoneo i risultati. Dal 2005 comincia quindi lo sviluppo della cartella elettronica InterAll della ADL, che sarà pienamente attiva nel 2008 e completamente interfacciata al sistema ISAC dall’inizio del 2009. InterAll è un modulo esterno della piattaforma Allergome e con questa dialoga scambiando dati in tempo reale. Allergome le fornisce la nomenclatura e la codifica esatta degli allergeni, nonché molte delle loro caratteristiche come disponibili sulla piattaforma stessa. InterAll è oggi utilizzato quotidianamente per il lavoro in rete dagli specialisti del CAAM, ha la sua interfaccia utente sviluppata in 6 lingue (francese, italiano, inglese, portoghese, spagnolo, tedesco) e la possibilità di refertare i test allergologici nelle stesse lingue in automatico.
ISAC veniva quindi acquisito dalla più grande azienda di diagnostica allergologica mondiale, che lo ha portato nel 2011 all’attuale versione 112. Gli attuali ricercatori del CAAM, sempre in collaborazione con il centro di Vienna, sviluppano tre versioni sperimentali di ISAC denominate 96, 131, 167. Ognuna di queste è utile alla sperimentazione di nuove molecole allergeniche che vengono individuate e prodotte da IBBR-CNR e altri centri di ricerca, e raccolte dagli attuali ricercatori del CAAM. Concettualmente diverse, queste versioni sperimentali del test in microtecnologia permettono di esplorare nuovi aspetti e impieghi. Tra i tanti, con ISAC 96 viene eseguito il dosaggio contemporaneo delle IgE e delle IgG, permettendo per la prima volta con un singolo test la diagnosi di malattia allergica e di quella autoimmune. Le conoscenze sviluppate dagli esperti attuali del CAAM vengono successivamente investite nello sviluppo di un nuovo tipo di microarray basato su microbeads. Il test sviluppato con successo e denominato Allergen Beads Assay (ABA) sostituisce completamente altre storiche metodiche di laboratorio di ricerca come l’ELISA, ed è utilizzato per la caratterizzazione di nuove molecole allergeniche.
Gli sviluppi subentranti delle 3 tecnologie non si sono ovviamente fermati. Pur pienamente integrate tra loro e utilizzate nella routine diagnostica e nella ricerca allergologica solo dai medici specialisti del CAAM, hanno offerto la possibilità di un ulteriore progresso nel loro utilizzo, continuando a far crescere le nostre conoscenze.
Era possibile quindi ipotizzare che molti nuovi aspetti delle 3 tecnologie fossero suscettibili di essere utilizzati in biomedicina, a beneficio della ricerca, della diagnosi e cura delle malattie da allergia.
Il processo in corso per trasformare in modo moderno l'allergologia porta nel 2016 al rilascio della prima versione del sistema di test FABER che, ancora una volta, trae vantaggio dall'uso delle più avanzate tecnologie. Lo sviluppo e realizzazione del sistema FABER basato sulle nanotecnologie permette di aumentare la completezza. la precisione, la sensibilità del test ma soprattutto il numero di preparati allergenici su cui effettuare il dosaggio delle IgE specifiche, senza aumentare le necessità complessive, inclusi i costi, del test.
